Aunque no se conoce con exactitud la fecha de su creación, se cree que el Hospital de la Santísima Trinidad se fundó en 1581 tras la absorción, por orden del Rey Felipe II, de los 19 hospitales que en ese momento existían en la ciudad. Estos hospitales estaban presididos por fundaciones religiosas y servían de refugio para peregrinos, pobres y enfermos; pero eran demasiado pequeños para atender a tantos pacientes.
Tras la nueva fusión, dos hospitales desarrollaban su actividad en Salamanca en ese momento: El Hospital de Santa María la Blanca y el Hospital de La Santísima Trinidad, al que denominaron Hospital General y cuya fuente de financiación provenía principalmente de las limosnas y de las obras teatrales contratadas por el prior y representadas en el patio del edificio.